HEMOGLOBINAS DE LEPTODACTYLUS VASTUS: UM MODELO PARA ENTENDER A BASE MOLECULAR DE ADAPTAÇÕES FUNCIONAIS EM HEMOGLOBINAS DE ANFÍBIOS

Resumo

Leptodactylus vastus, conhecida como rã pimenta nordestina, é um anfíbio de hábitos semiaquáticos endêmico da região nordeste do Brasil. O anuro habita formações como Cerrado e Caatinga. Na literatura, relata-se a existência de moléculas com potenciais biotecnológicos encontradas nessa espécie, como as proteínas de seu ninho de espuma. Entretanto, não há estudos sobre as hemoglobinas dessa rã. O objetivo deste estudo é avaliar aspectos estruturais e funcionais relacionados a adaptações respiratórias da hemoglobina de L. vastus. Para o estudo, capturou-se animais na Área de Relevante Interesse Ecológico da Matinha do Pici com a devida autorização do SISBIO. O sangue coletado dos espécimes foi centrifugado a fim de obter eritrócitos, os quais foram lisados e centrifugados com o intuito de aplicar o extrato bruto a uma cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose. Para avaliar o conteúdo proteico das amostras obtidas, utilizou-se SDS-PAGE (15%) em condições redutoras e não redutoras, além de espectrofotometria em dois comprimentos de onda, 280 nm e 540 nm. A Curva de Dissociação do Oxigênio (CDO) da hemoglobina foi obtida pelo método de Gilles-Gonzalez et al. (2008). Dicroísmo circular foi o método utilizado para a determinação da estrutura secundária da hemoglobina e sua termoestabilidade. Para a tentativa de cristalização da proteína, fez-se screens em placas de 24 poços pelo método da matriz esparsa e a técnica da gota suspensa. A partir dos experimentos realizados, três isoformas de hemoglobina foram purificadas pela cromatografia de troca iônica, apresentando alta afinidade por O2 (Kd = 4,5 µM) e baixa cooperatividade (nH = 1,24) intrínsecas. A proteína apresentou alta termoestabilidade (Tm = 75 °C) e predominância de hélices α. Não foi possível determinar a melhor condição para cristalização da hemoglobina de L. vastus. Mais experimentos esclareceriam a relação estereoquímica com as funções da hemoglobina de anfíbios.